摘 要:为了探讨酿酒葡萄品种对葡萄酒酿造过程中产生生物胺的影响,以赤霞珠、品丽珠、美乐和马瑟兰四个酿酒葡萄品种为试材，采用高效液相色谱法对比检测这些品种在酿造过程中生物胺种类和含量的变化。试验结果表明，所有品种葡萄汁中只检测到腐胺、乙胺，赤霞珠葡萄汁中检测到精胺；八种生物胺在发酵过程中均有检测到。其中，取样结束时，组胺、酪胺、精胺含量较高；美乐品种的总胺累积量最高、而品丽珠的总胺累积量最小。
关键词:生物胺；葡萄品种；高效液相色谱
1.引 言
当人体吸收过量的生物胺时，会引起头痛，呼吸紊乱，心悸，血压变化等过敏性反应。生物胺包括甲胺、乙胺、腐胺、尸胺、色胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺等。组胺对人类的健康的影响最大，其次是酪胺。除了组胺、酪胺本身的作用外，其他生物胺的存在会增强组胺和酪胺的不良作用。在发酵食品如酸奶，发酵香肠，泡菜及葡萄酒中，大都含有生物胺。生物胺在人体细胞内会被一些酶促代谢反应降解，但乙醇和乙醛能抑制这么酶的活性。少数人饮用葡萄酒产生头疼就是典型例证。研究表明，葡萄酒中的生物胺有两个来源:葡萄原料和发酵过程。Vidal-Carou等人最早在葡萄汁检测出组胺，酪胺，随后García-Villar等研究发现葡萄汁也存在微量的挥发性胺和多胺物质。发酵过程中存在的生物胺主要是由葡萄酒苹果酸-乳酸菌(Malolactic Bacteria, MLB)在苹果酸-乳酸发酵（Malolactic Fermentation,MLF）过程中对氨基酸脱酸产生的。葡萄酒中含有多种氨基酸，在MLB产生的脱酸酶作用下脱羧而生成组胺、酪胺、尸胺、精胺等生物胺，其中组胺、酪胺、腐胺等为葡萄酒中主要的生物胺。研究发现虽然酵母菌不直接促进氨基酸产生生物胺，但是酒精发酵（AlcoholFermentation,AF）过程中改变葡萄醪中的氨基酸的组成从而间接影响生物胺的产生。
目前，大部分研究集中在生物胺的检测上，酿酒葡萄品种在生物胺安全性的评价以及与其他酿造工艺因素之间的相互作用报道很少。本试验以赤霞珠、品丽珠、美乐和马瑟兰等四种主要酿酒葡萄品种为研究对象，采用高效液相色谱法对葡萄汁、酒精发酵结束时和苹乳发酵结束时生物胺的组成含量进行了测定，以探讨不同的酿酒葡萄品种、以及与其酿造微生物菌种相互作用对葡萄酒中生物胺产生的影响。
2.材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验材料
本研究所用葡萄酒样均取自中法庄园（2009）。以赤霞珠（Cabernet Savignon）、品丽珠（Cabernet Franc）、美乐（Merlot）和马瑟兰（Maserlan）发酵期间的酒样为试材。均采用带皮浸渍发酵。每次取样50ml，重复三次。取后的酒样放在-20℃冰箱中保存。
2.1.2 仪器与试剂
试剂：组胺（Histamine），酪胺（Tyramine），亚精胺（Spermidine），精胺（Spermine），乙胺（Ethylamine），腐胺(Putrescine)，甲胺（Methylamine），尸胺（Cadaverine）标准样品，苯甲酰氯（Benzoyl chloride）均购自Sigma；甲醇（高效液相色谱级），乙腈，氢氧化钠，乙醚，氯化钠，无水硫酸钠，盐酸，醋酸均为分析纯。
仪器：高效液相色谱仪,型号2695，美国Waters 公司; 反相C18 柱（250mm×4.6mm，5μm），德国Merck 公司。
2.2 方法
2.2.1 色谱条件参照 ?zdestan 等（2009）的方法并作稍加修改，色谱柱：反相C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A(pH=6.0)：V（0.05M 醋酸）/V(甲醇)=60/40，流动相B：甲醇；紫外检测：检测波长254nm；进样量：10μL；柱温20℃；梯度洗脱：流速0.6mL/min，梯度洗脱。
2.2.2 标准溶液的制备
分别称取组胺、酪胺、尸胺、乙胺、精胺、亚精胺、甲胺、腐胺，这8种生物胺10.0mg-18.0mg，用0.1M HCl 溶液溶解并转移到100mL 的容量瓶中，用0.1M HCl 溶液定容至刻度，封口，作为标准贮备液，在4℃保存备用三个月。使用前，根据实验需要将此标准贮备液用0.1M HCl 溶液稀释至适宜含量，以配制标准工作液和混合标准工作液，进行HPLC 分析。
2.2.3 样品的制备
参照zdestan 等（2009）方法并稍作修改：15mL 酒样用15mL 浓度为0.1M HCl混合，在2150g 转速下离心30min，收集水层，按衍生程序衍生，高效液相色谱进样检测。
2.2.4 衍生程序
参照zdestan 等（2009）方法并稍作修改：5mL 提取液，加入0.5mL 蒸馏水、3mL(浓度为5M/L)NaOH,于通风橱内加入100μL 苯甲酰氯，混合漩涡器下振荡1min,再加入3mL 乙腈，在25℃下反应60min，加入5mL 饱和NaCl 溶液，用4mL 乙醚分三次提取衍生产物，合并上层有机提取相，加入1g 无水硫酸钠，1mL/min 氮气吹至近干，用移液枪准确量取1mL甲醇溶解残留物，10μL 进样检测。
3.试验结果
3.1 标准工作曲线的建立
分别准确配制 8 个不同浓度的8 种生物胺混合标准溶液，按照2.2.3 和2.2.4 方法进行衍生处理，进样10 μL，按上述确定的色谱条件测定，以峰面积Y 为纵坐标，质量浓度X 为横坐标，计算得到8 条标准曲线。
组胺等8 种生物胺标准品的溶液浓度和检测响应值呈现出良好的线性关系，并且8 种生物胺的最低检测限都较低，表明此方法灵敏度较高。
3.2 生物胺含量的测定
四种红葡萄品种生物胺的总含量在发酵结束时，都有不同程度的增加。酒精发酵结束时，四种红葡萄品种生物胺的总含量增加起伏不大，而苹乳发酵启动之后，生物胺总含量增加幅度明显。
赤霞珠、马瑟兰生物胺的总含量随着发酵过程的不断延长而增加，品丽珠、美乐则是先减少后增加，这主要是因为在酒精发酵结束前，乙胺、腐胺占其总胺组成比例很大，分别为35%~65%、30%~35%和20%~55%、10%~45%，而两者降解的速度大于其他生物胺合成的速度。
发酵前期乙胺含量占总胺含量比例最大，其次是腐胺，两者在AF 结束时大幅度减少。发酵中后期（AF 发酵结束时至MLF 发酵结束20 天）却是组胺、酪胺含量占总胺含量比例很大，是因为随着总胺不断的增加，环境pH 值逐渐升高，而组氨酸脱酸酶，酪氨酸脱羧酶在pH 较高的环境里活性较大，将组氨酸、酪氨酸更多地转化为组胺、酪胺。
葡萄汁中均未检测到甲胺、尸胺、亚精胺，这三种胺的含量都随着发酵时间的延长而各自不断增加。其中甲胺的增长幅度较小，且含量也较少；亚精胺的增长幅度较大，取样结束时含量较高。乙胺、尸胺在AF 结束时略微增加，在MLF 阶段积累量较大。赤霞珠、马瑟兰的亚精胺含量与同一时期的美乐、品丽珠的亚精胺含量相较，差别较大。葡萄汁中检测到乙胺、腐胺，且两者的含量都比较高，总体趋势是随着发酵的不断进行，两者的含量都有所下降。其中，四种品种葡萄汁中的乙胺含量水平差别不大，美乐品种的乙胺含量在AF 阶段减少幅度较大，取样结束时乙胺含量接近于零。腐胺在赤霞珠、品丽珠、美乐葡萄汁中含量较高，酿造过程中不断减少，MLF 结束后至取样结束时含量又都有所回升；马瑟兰葡萄汁中未检测到腐胺，并且其含量随着发酵不断进行而均匀增加。
四大红葡萄品种酿造过程中精胺含量逐渐增加。赤霞珠、品丽珠、美乐精胺含量呈现线性增长，而马瑟兰精胺含量呈现“S”曲线增长，并且精胺含量的前段累积主要在榨汁后至AF 结束前这段时间。
四种红葡萄在酿造前后组胺含量增加明显，从最开始的没有检测到最后平均水平在3.0mg/L 左右（比较其他研究组胺检测结果），其中AF 结束前，赤霞珠、品丽珠、马瑟兰组胺含量增加幅度小，四大品种的组胺含量都是在AF 结束时到MLF结束时这段时间增幅最大，MLF 结束后组胺含量又都有不同程度的减少。同时，可以看出美乐在酿造过程中组胺的含量远远高于其他品种，其原因还有待进一步研究。
四大红葡萄品种在酿造过程中酪胺含量逐渐增加。取样结束时美乐、马瑟兰酪胺的含量分别为4.54mg/L 和4.92mg/L，远大于赤霞珠的1.79mg/L、品丽珠的1.62mg/L， MLF 结束时至MLF 结束20 天后此段时间，美乐、马瑟兰中酪胺含量增幅较大，在酿造工艺上与赤霞珠、品丽珠比较时，两者添加的酿酒酵母不同，前两者为酵母BDX，后两者为酵母FX10。
4.讨 论
检测结果表明，葡萄汁中生物胺总的含量很低，主要是乙胺、腐胺、精胺，这一结果与Del Prete（2009）等发现在葡萄汁中存在乙胺、腐胺的结果相一致，但是其检测腐胺含量平均约为10mg/L，远大于本试验结果4~5mg/L。赤霞珠、品丽珠、美乐葡萄汁中腐胺含量差别较小，而马瑟兰葡萄汁中未检测到，可能是由于赤霞珠等品种种植土壤中钾含量偏低而造成的多胺即腐胺在葡萄果实中积累量较大。
试验结果表明乙胺、腐胺的含量在苹乳发酵结束前随着发酵时间的延长而不断减少，此现象的原因，Del Prete（2009）等认为是乙胺在AF 过程中不断减少是因为它可以作为酿酒酵母的氮源和碳源而被分解代谢。Igarashi（1999）等研究腐胺在MLF 发酵结束前不断的减少是因为它是一种多胺，酵母菌、乳酸菌将其代谢分解作为精胺和亚精胺的前体物质，腐胺的吸收取决于膜电位，而排出却涉及腐胺与鸟氨酸之间的交换反应；苹乳发酵结束20 天后又都有不同程度的增加，可能是因为MLF 中的乳酸菌对酵母自溶蛋白产生的氨基酸进行脱酸而产生。
甲胺、尸胺、亚精胺的含量等都随着发酵时间的延长而不断增加。MLF 结束20 天时尸胺含量在0.45mg/L~1.3mg/L 范围内，而Rosi 等检测MLF 结束30 天后尸胺的含量在0.3mg/L左右;在MLF 结束20 天时亚精胺含量范围为0.5mg/L~4.5mg/L，远小于Manfroi 研究结果中的14.7mg/L~17.3mg/L。
试验表明葡萄汁并不含有精胺，发酵过程中精胺含量不断累积上升，而同一酿造阶段马瑟兰精胺含量显著大于其他品种，究其原因可能是马瑟兰品种携带精胺前体物质精胺羟基酸配合物大于其他品种，或者是机械破碎时灭菌不彻底，葡萄皮上携带的细菌等微生物代谢氨基酸。
组胺在AF 结束时含量很低，主要产生于MLF 过程中，品种间含量差别较大（1mg~10mg/L），而Soufleros 检测到葡萄酒中的组胺含量为0.42mg/L。MLF 结束后组胺含量的略微下降可能由于是组胺具有热不稳定性，易降解。
结果显示葡萄汁不存在酪胺，但是有些研究结果表明葡萄汁中存在微量酪胺。研究证明，AF 存在少量酪胺，是因为水解葡萄汁中酪胺羟基酸配合物而来，并不是酵母菌产生的。葡萄中存在羟基酸配合物相关研究报道不多，但是羟基酸配合物是普遍存在于植物体中。美乐、马瑟兰与赤霞珠、品丽珠酪胺含量差别显著，可能是因为AF 过程中，酵母的生化代谢造成了AF 结束时品种间氨基酸组成和含量的差异从而间接影响了MLF 过程中乳酸菌代谢氨基酸产生生物胺的能力。
生物胺总量的积累主要集中在MLF 阶段，这一结果与大部分已有研究相一致。此现象是因为发酵过程中，生物胺主要来源于乳酸菌利用氨基酸脱羧酶对氨基酸进行脱羧。
5. 结 论
总之，酿造而成的葡萄酒中生物胺的含量会受到酿造葡萄品种原料的影响，但是葡萄酒中生物胺的产生是一个极其复杂的现象，还必须与酿造处理工艺、酿造菌种等因素相结合考虑。
基于上述试验研究，建议对葡萄酒工业酿造菌包括酿酒酵母，苹果酸乳酸菌进行生物胺产生能力的评价检测，同时，寻找合适的生物胺除去剂，为葡萄酒生物胺安全性提供可靠的支撑，更好地指导实际生产酿造。
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